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推荐:常用的分子生物学基本技术
作者:未知 来源:新华社 时间:2005-11-30


      差异杂交(differential hybridization)

      是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同cDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA)分别与滤膜上的DNA杂交,分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物(如酵母)表达基因的比较,假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低(仅5%左右),价值不大。

      cDNA微点隈杂交(cDNA microarray hybridization)

      是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNA探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低,适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。

      寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotide microarray hybridization)

      是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面,与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交,以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征,或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。

      液相杂交(solution hbridization)

      指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链(探针)在溶液中保温,使之形成杂交复合物。反应结束后,用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开,然后结膈后在杂妆分子中的探针量,就可推算出被测的核酸量。

      递减杂交(subtractive hybridizatio)

      是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA(或逆转录成的cDNA),在一定的条件下以过量的驱动mRNA或cDNA与测试的单链cDNA或mRNA进行液相杂交,通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之间相同的基因成分,保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选cDNA文库,可获得特异表达的目的基因cDNA全长序列。

      核酸原位杂交

      用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其实行检测的方法,称为核酸原位杂交(nucleic acid hybridization in situ)。用来检测DNA在细胞核或染色休上的分布,与细胞内RNA进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰;还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。

      该法的优点是特异性高,可精确定位;能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响;不需要从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性;并可完整地保持组织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学生物学的研究,如基因定位、基因制失,基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。近年来由定性发展到定量,方法更为完善。

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