需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。实验证明，以T结尾的引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸。 
⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置 
所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。 
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120～300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。 
   其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250～750bp范围内。 
⑦补充说明 
    若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。 
  若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。 
   在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5’和3’末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。 

3．简并引物设计 
①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。很显然，我们期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。 
②充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。 
③应努力避免3’末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。 
④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。 

4． 测序引物设计 
   当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计的话；那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点： 
①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。 
②测序引物的Tm值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。 

5． 探针的设计 
    探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论： 
①探针的长短一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。 
②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同时一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。 
③探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。 
④如果探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在70%以下。 
PCR中常见问题分析与对策． 
PCR产物的电泳检测时间 
一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型就会出现不规则，甚至消失。

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] [6]