==================================================== 
dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10% 
formamide at 5% 
trimethylammonium chloride 10-100uM 
detergents such as Tween 20 0.1-2.5% 
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15% 
glycerol 10-15% 
single stranded DNA binding proteins 
Gene 32 protein 1nM 
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM 
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP 
Taq Extender (stratagene) 
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene) 
Q-solution(Qiagen) 
==================================================== 
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度 

11. Template DNA preparation 
  提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase. 

12. Nested PCR 
  简单点说 设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况. 

增加PCR的保真性 

高保真酶 
  高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型 
   a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变 
   b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase 
   c.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。 
  

酶的混合物 
  将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。 

其他因素 
  除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。 

1．简介 
   寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页