3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度，对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液
b. 其他的离子
NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性
d. template
50ul PCR SYSTEM
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human gDNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
LamadaDNA 0.5ng-5ng
Plasmid DNA 0.1ng-10ng
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4. termperature
a. denaturation
常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟
除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation
b. annealing
重点到了：一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子，ANNEALING TEMP. 55度
94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s
72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s
51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s
72 1min 20cycles 72 5min
6. hot start PCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时， 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。
