三、注意事项

1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。

3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。

4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。

　
可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞
说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了
如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了
第二次的引物设计要求可以低一点
以50μl体系为例
引物各1μl
第一次PCR产物5μl

二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量

我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.

luoyu10 wrote:
各位大哥：
我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？

最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。

问：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想请教引物如何设计？

好的引物所具有的令人满意的特点：
*  典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
*  选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
*  设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
*  避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
*  避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
*  避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
*  避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

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