一步法同两步法RT-PCR的比较
两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点（表3）。
一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增（图9）。
对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。
| 两步法步骤 | 一步法步骤 |
| 起始第一链cDNA合成使用： | 起始第一链合成使用 |
| Oligo(dT) | GSP引物 |
| 随机六聚体 | |
| GSP引物 | |
| 优点 | 优点 |
| •灵活 | •方便 |
| 引物选择 | 扩增酶同逆转录酶预先混合 |
| 扩增酶的选择 | 转管步骤少，减少污染可能性 |
| •困难RT-PCR的优化能力 | •高灵敏度 |
| 同Platinum®酶结合提高特异性 | •适用于大量样品分析 |
| 同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性 | •适用于定量PCR |
| •适用于在单个样品中检测几个mRNA | |
| 关于扩增酶和产物大小应注意： | |
| •对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶 | |
| •对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | |
| •对于大于12kb的产物使用ELONGAE® Enzyme Mix | |
| •对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。 | |
增加RT-PCR特异性
第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。
随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3’端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。
