为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。
SuperScriptⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。
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| 图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响 |
在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的[α- P]dCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。 |
图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响
以oligo(dT)为引物，使用ThermoScriptⅡ或AMV，在50℃下由Hela细胞总RNA合成cDNA。使用Platinum® Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶ε引物进行35个循环。
图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响
人tuberous scherosis ⅡmRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶εmRNA的全长cDNA的合成由SuperScriptⅡ和MMLV催化。利用oligo(dT)为引物，由5μg Hela细胞总RNA合成cDNA。样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。
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| RNaseH产生的障碍 |
| RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。 |
