增加RT-PCR灵敏度
分离高质量RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
| TRIzol®试剂步骤略图 |
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一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。
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| 图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较 |
| 以5或1μg Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA（分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶εmRNA 5'端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。 |
