TOPO PCR表达克隆法
传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上.
这会导致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，
从而影响蛋白表达和蛋白的功能。
利用TOPO克隆技术把PCR产物直接克隆至表达载体，则可避免这种情况。
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TOPO PCR表达克隆法仍利用特异引物把目标基因PCR扩增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把产物快速连接到T表达载体上，这是到载体上的目标基因不含非编码区，Invitrogen提供了原核细胞、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的各种PCR克隆表达系统。 |
PCR和RT－PCR常见问题及解答
| 问 题 | 可能原因 | 建议解决方法 |
| RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 | RNA被降解 | 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 使用良好的无污染技术分离RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理 在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 |
| RNA中包含逆转录抑制剂 | 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。 将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 | |
| 多糖同RNA共沉淀 | 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 | |
| 用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 | 确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。 对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。 | |
| 起始RNA量不够 | 增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 | |
| RNA模板二级结构太多 | 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。 注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。 对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。 | |
| 引物或模板对残余的RNA模板敏感 | 在PCR前用RNaseH处理。 | |
| 靶序列在分析的组织中不表达 | 尝试其他靶序列或组织 | |
| PCR没有起作用 | 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物 | |
| PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 | PCR引物设计较差 | 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 |
| DNA含有抑制剂 | 诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA | |
| 富含GC的模板 | 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 | |
| 模板浓度太低 | 使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 | |
| 镁离子浓度太低 | 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。 | |
| 退火温度太高 | 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。 | |
| PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 | 引物浓度太低 | 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1，2） |
| RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带 | 引物和模板非特异性退火 | 在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。 |
| GSP设计较差 | 遵循用于扩增引物设计的同样原则 | |
| RNA中沾染了基因组DNA | 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 | |
| 形成引物二聚体 | 设计在3'端没有互补序列的引物。 | |
| 引物和模板非特异性退火 | 以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。 | |
| 镁离子浓度太高 | 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 | |
| 因为扩增复杂模板导致引物错误起始 | 使用巢式PCR或递减PCR。 | |
| 沾染外源DNA | 使用抗气雾剂的吸头和UDG（见第八章）。 | |
| 因为二级结构导致引物结合位点无法接近 | 对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。 | |
| PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误 | 聚合酶忠实性低 | 使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。 |
| 循环数太多 | 降低循环数。 | |
| 四种dNTP的浓度不同 | 制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 | |
| 定量RT-PCR 无扩增产量 相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照 |
无cDNA合成 | |
| cDNA合成温度太高 | 降低保温温度 | |
| 反转录cDNA产物被二级结构封闭 | 提高保温温度。重新设计引物 | |
| RNA被损害或降解 | 必要的话更换RNA | |
| RNAse污染 | 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 | |
| 荧光探针无功能 | 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 必要的话设计和合成探针。 | |
| 灵敏度低 须在比预期更高的循环中检出产物 |
初始模板RNA不充分 | 增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA |
| RNA被损害和降解 | 必要的话更换RNA | |
| RNAse污染 | 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 | |
| 无效的cDNA | 通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂 | |
| 无效的PCR扩增 | 注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺 调整cDNA合成温度或引物设计 | |
| 信号高于预期 在低于预期的循环中即可检出产物 |
反应中加的样品太多 | 降低模板的浓度 |
| 模板或PCR残余污染 | 隔离污染来源，更换试剂 使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。 | |
| 电泳后出现意外的条带 | RNA被基因组, DNA污染 | 用DNase I预处理RNA |
| 用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 | 使用基因特异性引物 | |
| PCR的低特异性 | 优化PCR条件 |
