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推荐:PCR与RT-PCR技术
作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-11-30

    部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳,和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。使用Maligen Gel Extraction System将目的产物从琼脂糖中纯化出来,这是一种基于硅土的,从凝胶中快速纯化DNA片段的技术。

    PCR产物克隆
    PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法,杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。
    但因为TA克隆法操作最简单,快速和高效的原因,成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明,并拥有全球TA Cloning商标的专利权。

    TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)

    利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基, 使得实验操作更为简单方便。

    所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物,不需将PCR产物进行优化,不需把PCR产物做平端处理(Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆)。不需在PCR扩增产物上加接头,即可直接进行克隆

    Topo TA克隆方法(Topo TA Cloning Kit)

    Topo TA克隆原理与TA克隆一样,唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上,而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。

    Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后,再连接成线性DNA。

    Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T端载体上,整个反应只需五分钟!一般T4连接酶需过夜才能高效连接。Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体,感受态细胞,SOC培养基等。

    1. Add 1ml of TOPO® Cloning vector to 1ml of the Taq-amplified PCR product   2. Incubate for 5 minutes on your bench top   3. Transform One Shot® Competent E. coli.

     

    Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法(Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit)(Topo XL PCR Cloning Kit)

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