巢式PCR
使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5’ RACE）的特异性。
增加PCR灵敏度
模板质量
模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA（表8）。
| Method | Description |
| Proteinase K/phenol extraction | Classic method |
| DNAzol® Reagents | Fast, phenol-free DNA isolation |
模板浓度
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意，104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（表9）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，对于足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。
| Genonic DNA | Size(bp)* | Target Molecules/µg of Genomic DNA | Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules |
| E. coli | 4.7×10^6 | 1.8×10^8 | 0.001 |
| Saccharomyces cerevisiae | 2.0×10^7 | 4.5×10^7 | 0.01 |
| Arabidopsis thaliana | 7.0×10^7 | 1.3×10^7 | 0.01 |
| Drosophila melanogaster | 1.6×10^8 | 6.6×10^5 | 0.5 |
| Homo sapiens | 2.8×10^9 | 3.2×10^5 | 1.0 |
| Xenopus laevis | 2.9×10^9 | 3.1×10^5 | 1.0 |
| 1.0Mus musculus | 3.3×10^9 | 2.7×10^5 | 1.0 |
| Zea mays | 1.5×10^10 | 6.0×10^4 | 2.0 |
| pUC 18 plasmid DNA | 2.69×10^3 | 3.4×10^11 | 1×10^(-6) |
| *Haploid genome size | |||
酶的选择
除了使用高质量模板DNA，聚合酶的选择也会影响产量。Platinum聚合酶比其他聚合酶产量高，因为它防止了PCR反应配制过程中的非特异性扩增（图24）。对长片段（最大到12kb）的高灵敏度PCR，应选择酶混合物，最好是Platinum形式，如Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。这种酶结合了Platinum技术和酶混合物（Taq DNA聚合酶同带有校正功能的聚合酶混合物）的优点。
