热启动
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效（图20）。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制以及在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用Platinum Taq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。
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| 图20. 使用Platinum® Taq DNA聚合酶增加特异性 |
| A组. 人基因组DNA内克隆的HIV DNA的检测。带有HIV gag区域的1000个质粒DNA拷贝同100ng的基因组DNA混合，使用gag区域的引物进行扩增。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，通过在94℃加入酶而手工热启动。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组. 由100ng人基因组DNA扩增4.1kb的人β-球蛋白。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。 |
镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化（图21）。
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| 图21. 使用Platinum® Taq DNA聚合酶拓宽镁离子浓度范围 |
| 由100ng人基因组DNA扩增人β-球蛋白基因的2.8kb区域。A组，使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。B组，使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。 |
