二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10 分钟,然后于
4℃下
3000g 离心10 分钟。
2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L 的CaCl
2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30 分钟后,
4℃下
3000g 离心10 分钟。
3、弃去上清,加入4ml 预冷含15%甘油的0.05mol/L 的CaCl
2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl 的小份,贮存于
-70℃可保存半年。
三、 转化
1、从
-70℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、 加入pBS 质粒DNA 溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30 分钟后。
3、
42℃水浴中热击90 秒或
37℃水浴5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。
4、向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp),混匀后
37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,
37℃培养16-24 小时。同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
四、 计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg 质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA 加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
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