第三节 操作步骤

一、 DNA 酶切反应

1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg 和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、 混匀反应体系后,将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3 小时,使酶切反应完全。

3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。

二、DNA 分子量标准的制备采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA 片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA 为长度约50kb的双链DNA 分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII 切割 DNA 后得到8 个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56 和0.12kb。EcoRI 切割lDNA 后得到6 个片段,长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和2.5kb。

三、 琼脂糖凝胶的制备

1、 取5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。

2、 胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。

向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E 溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB 加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml 的EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4、 加样：取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA 含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip 头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

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