二. 凝胶电泳

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, E 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带,用于以后的克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp 至近50kb 的DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp 的DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA 电泳。

琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

1、 DNA 的分子大小:

线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA 分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2、 琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA 分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb 的DNA 分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3、 DNA 分子的构象

当DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA 移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA 带难以确定是质粒DNA 不同构象引起还是因为含有其他DNA 引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA 带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA 图谱,则为同一种DNA。

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