在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
分配系数Kav既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要测出床体积Vt 和外水体积Vo 以及洗脱体积Ve，即可计算出Kav值。而凝胶床总体积Vt可用测量法得到：
由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体积Vo、内水体积Vi与凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即
Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi
而Vo和Vi可通过实验测得：当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则能进入部分凝胶网孔中，故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之间（Kav在0－1之间）。
以床体积Vt（等于pr2h）和测得值Vo来计算分配系数的值为Kav，若以床体积Vt（等于Vo+Vi）和测得值Vo来计算分配系数的值为Kd。在同一层析条件下，对同一物质计算出来的Kav和Kd值尽管有一定的差异性，但都是有效的。只因Kav计算方便，所以目前多使用Kav。分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav和Kd表示外，还可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。
反应原理
凝胶过滤不仅常用做物质的分离，还可以根据需要用某种试剂非常方便地处理某种物质，当该物质流经试剂区时，因为可连续接触新鲜试剂，因而可以充分发生反应，最后经过洗脱，再与过量的试剂分开。本实验就是通过凝胶过滤，用还原剂FeSO4处理血红蛋白。即首先在层析柱中加入含有还原剂的溶液，使形成一个还原区带，当血红蛋白样品（血红蛋白与铁氰化钾的混合液）流经还原区带时，褐色的高铁血红蛋白立即生成紫色的还原型血红蛋白，随着还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧分子结合又形成了鲜红的血红蛋白。铁氰化钾则因分子量小，在层析柱中呈现其本来的黄色带而远远地落在血红蛋白的后边。本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼观察即可检验分离效果。
