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荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)
作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-11-24


    2)去离子甲酰胺(DF):将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min,用Whatman l号滤纸滤。
    3)体积分数70%甲酰胺/2×SSC:35mL甲酰胺,5mL 20×SSC,10mL水。
    4)体积分数50%甲酰胺/2×SSC:100mL甲酰胺,20mL 20×SSC,80mL水。
    5)体积分数50%硫酸葡聚糖(DS):65oC水浴中融化,4oC或-20oC保存。
    6)杂交液:8µL体积分数25%DS,20µL 20×SSC混合。(或40µL体积分数50%DS,20µL 20×SSC,40µL ddH2O混合)取上述混合液50µL,与5µL DF混合即成。其终浓度为体积分数10%DS,2×SSC,体积分数50%DF。
    7)PI/antifade溶液
    PI原液:先以双蒸水配置溶液,浓度为100µg/mL,取出1mL,加39mL双蒸水,使终浓度为2.5µg/mL。
    Antifade原液:以PBS缓冲液配制该溶液,使其浓度为10mg/mL,用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL,加9mL甘油,混匀。
    PI/antifade溶液:PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀,-20oC保存备用。
    8)DAPI/antifade溶液:用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液,按体积比1:300,以antifade溶液稀释成工作液。
    9)封闭液I:体积分数5%BSA 3mL,20×SSC 1mL,ddH2O 1mL,Tween20 5µL混合。
    10)封闭液II:体积分数5% BSA 3mL,20×SSC 1mL,goat serum 250µL,ddH2O 750µL,Tween20 5µL混合。
    11)荧光检测试剂稀释液:体积分数5% BSA 1mL,20×SSC 1mL,ddH2O 3mL,Tween20 5µL混合。
    12)洗脱液:100mL 20×SSC,加水至500mL,加Tween20 500µL。
    实验方法及步骤
    1)探针变性
    将探针在75oC恒温水浴中温育5min,立即置0oC,5~10min,使双链DNA探针变性。
    2)标本变性
    ①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片2~3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。
    ②取出玻片标本,将其浸在70~75oC的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2~3min。
    ③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水,每次5min,然后空气干燥。
    3)杂交
    将已变性或预退火的DNA探针10μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上,盖上18×18盖玻片,用Parafilm封片,置于潮湿暗盒中37oC杂交过夜(约15~17h)。由于杂交液较少,而且杂交温度较高,持续时间又长,因此为了保持标本的湿润状态,此过程在湿盒中进行。

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