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Northern blot技术
作者:未知 来源:晶美生物 时间:2005-11-24


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    电泳结束后(溴酚蓝迁移出区8cm),切下分子量标准参照物的凝胶条,浸入溴化忆锭溶液(0.5μg/ml
       
    0.1mol/L乙酸铵配制)中染色30-45分钟。在凝胶放置一透明迟,在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离,以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图,用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。
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    RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜,将RNA转移至尼龙膜。

    将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜

      电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜,有以下几种转移方法:毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述, 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必(Thomas1980)甚至有害(Thomas1983),
       
    但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次,除去甲醛。 如果琼脂糖中浓度大于1%或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜,RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
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    )将凝胶移至一个玻璃皿内,用锋利刀片修凝胶的无用部分,在凝胶左上角(加样孔一端为上)切去一角,以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。
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    )用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台,将其放入大千烤皿内,上面放一张Whatman 3MM滤纸,倒入20xSSC使液面略低于平台表面,当平上方的3MM滤纸温透后,用玻棒赶出所有的气泡。
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    )用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜(Schleicher Schuell BA85或与之相当的产品)。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm 接触滤膜时须戴手套或用平头镊子(例如Millipore镊子),用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。
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    )将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面,直至滤膜从下向上湿透为止,随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟,用干净的解剖刀片切去滤膜一角, 使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜,其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透,应另换一张新滤膜,因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。这种滤膜也不必丢弃,可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间, 高压5分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间,装入塑料袋, 密封后于4℃保存备用。
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    )将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央,3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。
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    )用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边,但不是覆盖凝胶, 以此作为屏障,阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾,易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触,这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。

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