六、聚合酶链式反应（PCR）技术
PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是ssDNA片段。待扩增DNA模版加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。此时，两引物的3'端相对，5'向背。在合适的条件下，由Taq DNA聚合酶催化引物引导的DNA合成，既引物的延伸。上述过程是由温度控制。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。理论上扩增产物量成指数上升，既n个循环后，产量为2n拷贝。典型的PCR操作过程如下：
1、 反应体系：
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体积 |
成分 |
工作液浓度 |
终浓度 |
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14.0 µl |
PCR Water |
—— |
—— |
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2.5 µl |
10X Taq Buffer |
10X |
1X |
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1.5 µl |
MgCl2 |
25 mM |
1.5 mM |
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4.0 µl |
*dNTP Mix |
1.25 mM each dNTP |
0.2 mM each dNTP |
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0.25 µl |
Primer 1 |
100 pmoles/µl |
1 µM |
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0.25 µl |
Primer 2 |
100 pmoles/µl |
1 µM |
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0.25 µl |
Taq DNA Polymerase |
5 U/µl |
0.05 U/µl |
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2.5 µl |
DNA |
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25 µl |
Total Reaction Volume |
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（反应溶液可置于毛细管或薄壁离心管中扩增）
2、操作过程：（所用仪器为AMP1605热循环PCR扩增仪
预变性：94℃ 90秒
循环过程：94℃ 1秒 48℃ 1秒 72℃ 40秒 40个循环
延伸：72℃ 5分钟
3、检测：琼脂糖电泳检测。
