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大肠杆菌质粒DNA的提取
作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-11-24

    (1)琼脂糖凝胶电泳装置

        由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高,而适应性又强,在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。

        水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中,则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同,所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。

    2)琼脂糖凝胶的制备

        琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中,令其固化。凝固后,琼脂糖形成一种固体基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。

    3)琼脂糖凝胶的染色

        电泳完毕,将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中,染色10分钟,取出紫外灯下观察。

    三、大肠秆菌感受态细胞的制备

        感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA,而常态的细胞却不能,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

      1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜

      2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中,37℃振荡培养3hOD600=0.3

      3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中,冰浴10min

      4、在4℃下以4000rpm离心5min,去上清液

      5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中,置冰上30min

      6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min,去上清液

      7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中,冰浴放置4-12hr备用。

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