①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。
⑤如③水洗。
⑥缓冲甘油封固，镜检。
间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。
（三）补体法
1．材料
（1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。
（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。
2．方法步骤
（1）涂片或切片固定。
（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。
（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。
（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。
（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。
