二、透射电子显微镜观察方法
1）透射电镜样本的取材和固定
培养细胞的取材和固定
1．常规收集帖壁和悬浮细胞，置离心管中离心，800～1000r/min，10min。
2．用0.01mol/L PBS 5ml重悬细胞。
3．将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。
4．离心，2000r/min，15～20min，使细胞成团。
5．小心吸去上清，加入2.5％戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。
6．取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。
7．将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中，4℃（可长期）保存。
8．用0.1mol/L PBS缓冲液洗1次。
9．1％锇酸后固定30～60min。
三、荧光显微镜观察方法
1）吖啶橙染色法
1．制备活细胞悬液，浓度约为107/ml。
2．取95μl的细胞悬液，加5μl的吖啶橙贮存液混匀。
3．吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。
4．荧光显微镜选用激发滤片BG 12或BV等，阻断滤片用515nm或SP3。
2）Hoechst33258染色法
1．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。
2．细胞固定液4℃固定5min。
3．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。
4．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。
5．封片剂封片后荧光显微镜观察。
3）Hoechst33342染色法
1．将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml 37℃孵育30min。
2．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。
3．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。
4．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。
以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：
1．收集（0.5～3.0）×106个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。
2．PBS洗1次，500～1000r/min，离心5min去PBS。
3．用3％多聚甲醛50μl重悬细胞，室温下固定10min。
4．PBS洗1次，500～1000r/min离心5min去PBS。
5．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。
6．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞，计算调亡率。
