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免疫胶体金的制备及其在医学检验中的应用
作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-11-22


    胶体金是一种常用的标记技术,有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。
      1971Faulk Taytor将胶体金引人免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAgHCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。

    免疫胶体金技术的基本原理

      氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
      免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。

      

    胶体金的制备方法
      胶体金的制备一般采用还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。
      1、玻璃容器的清洁:玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成,一切玻璃容器应绝对清洁,用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分钟,室温干燥后蒸馏水冲洗,再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面,弃去后以双蒸馏水淋洗,可代替硅化处理。
      2、试剂、水质和环境:氯金酸极易吸潮,对金属有强烈的腐蚀性,不能使用金属药匙,避免接触天平称盘。其1%水溶液在4℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少,否则实验的结果将缺乏重复性。
      金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变,应选用缓冲容量足够大的缓冲系统,一般采用柠檬酸磷酸盐(pH35.8)Tris-HCL (pH5.88.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.510.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。
      3、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶:
      取0.01%氯金酸水溶液100ml 加热至沸,搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液 0.7ml,金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色,继续煮沸15分钟,冷却后以蒸馏水恢复到原体积,如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm,A1cm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关,一旦颗粒大小发生变化,光散射也随之发生变异,产生肉眼可见的显著的颜色变化,这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。

      金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的柠檬酸三钠量,可制得不同颜色的金溶胶,也就是不同粒径的金溶胶,见附表。

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