1.2  培养心肌细胞的鉴定

1.2.1 心肌细胞形态观察  常规倒置显微镜观察细胞形态变化、心肌细胞搏动情况，并随时用Leica DMIRB Microsystems记录（Leica, 德国）；取培养心肌细胞单层飞片行苏木素－伊红染色（HE染色）后，光学显微镜下观察并照片。培养细胞用0.1％胰蛋白酶消化后，离心，沉淀固定，送电镜室制片，透射电镜观察并摄片。

1.2.2  细胞成活率的测定  取细胞悬液，并作适当稀释106/ml，按9:1加入0.4％台盼篮溶液混匀，显微镜下用计数器计数活细胞和死细胞。

1.2.3  鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（HHF35）的检测  采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连接法（Streptavidin peroxidase conjunction method, 简称S-P法）。具体步骤如下：单层细胞飞片清洗后95％酒精固定30min；PBS洗5min×3，滴加3％H2O2室温孵育10min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10min；滴加适当比例的一抗工作液，37℃孵育4℃过夜；PBS冲洗，5min×3，滴加生物素标记二抗工作液，室温孵育20min；PBS冲洗，5min×3，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20min；PBS冲洗，5min×3，滴加新鲜配制的DAB显色液显色5～10min；苏木素复染5～7min，1%稀盐酸分化1min，自来水返蓝；酒精剃度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并摄片。

2  结果

2.1 心肌细胞形态  倒置显微镜下可见传代细胞未贴壁呈圆形，贴壁后生长逐渐呈梭形、多角形，胞核1～2个、呈圆形、具有1～2清晰的核仁，细胞大小均匀，生长迅速，单个细胞自行蠕动，当生长成片后可见呈岛屿状搏动，搏动频率130～150次/分。培养心肌细胞HE染色细胞形态饱满、细胞膜完整；透射电镜观察细胞完整，胞膜皱褶整齐，细胞中肌丝、线粒体清晰、分布均匀，细胞核完整。（图1～3）

2.2  心肌细胞成活率测定  计数500个细胞，27个染色阳性，成活率94.6％。

2.3  肌动蛋白免疫细胞化学反应镜下观察  肌动蛋白HHF35经S-P法培养的心肌细胞胞浆呈现深浅不一的棕褐色阳性表达，任选5张飞片，分别计数100个细胞，阳性细胞达96.4％（图4）；而用PBS代替一抗其结果均为阴性。

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