【方法】
1试剂的配制
(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4％碳酸钠(NA2CO3)溶液与02Mol／L氢氧化钠(NAOH)溶液等比例混合(2％NA2CO3，01Mol NAOH)；B液：1％硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等比例混合(05％CuSO4·5H2O，0.1％酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为ＦolIn—酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于ＦolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(NA2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(NA2MoO4·2H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85％的H3PO450Ml，浓HCl 100Ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(LI2SO4·H2O)150g，水50Ml，溴水2～3滴，不用回流装置开口煮沸15Min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000Ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15Min)。使用时用标准NAOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol／L H＋酸，此为ＦolIn－酚试剂乙液(ＦolIn试剂)。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
（2）标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白，溶于100Ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg／Ml。
2标准曲线的绘制
（1）取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。
(2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30℃下放置10Min。
(3)在每支试管中喷射加入05Ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30Min。
(4)准确到30Min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1CM光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。
以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3样品的测定
(1)样品的提取：称取鲜样05g，用5Ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。
取10Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3)、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。
(2)根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。
4结果计算
样品中蛋白的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000(2-1）
式中C:查标准曲线值(μg)；
VT:提取液总体积(Ml)；
ＦW:样品鲜重(g)；
V1:测定时加样量(Ml)。
【注意】
还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
