二．细胞融合
1．以2：1混合脾细胞与骨髓瘤细胞；
2．加入培养基A到25ml；
3．在室温下，200 × g 离心7min，弃上清；
4．轻轻震动试管使松动沉淀，后置入37℃水浴；
5．用1000µl的加样器，缓慢（超过1min）逐滴加入700µl经37℃预温的PEG1500，并用吸头搅拌；
6．经过1 min后，缓慢（超过3min）加入5ml培养基A；
7．再过1 min ，加入7ml 37℃预温的培养基A；
8．隔1 min，再加入7ml 37℃预温的培养基A（以达逐步稀释）；
9．室温下，200 × g 离心10min，弃上清；
10．再将沉淀小心地悬浮于培养基C，使细胞终浓度为1 × 106 脾细胞/ml；
11．在已加100 µl培养基C/孔的2-3块96孔板中，再加入100 µl/ 孔细胞悬液；
12．置入含5-8%CO2的37℃培养箱中；
13．一周后，每孔吸出100 µl上清，再加入100 µl培养基C，继续每周换液1-2次；
14．后续操作见以下实验后述。 
实验要点及说明 
1．可用DMEM (4.5 g/l葡萄糖) 代替RPMI (2 g/l葡萄糖)；
2．B细胞与骨髓瘤细胞之比也可为1：1或1：1.5；
3．细胞融合操作是关键步骤，要避免以吸管用力吸打；
4．在细胞融合后2-3天，要注意检测是否污染；霉菌在培养箱中污染速度迅速。一旦发现污染，尽快弃出污染的培养皿；
5．在细胞融合后4-5天后，在显微镜观察可见到克隆。某些克隆可能在融合后7-8天才可见到；
6．在确定已得到对抗原有明显的滴度的抗体及筛选条件已优化前，不要开始细胞融合实验。 
参考文献 
1． Fazekas,de St Groth. And Scheidegger, D. (1980) Production of monoclonal antibodies: 
strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 35,1-21.
2． Galfre, G. And Milstein, C. (1981) Preparation of monoclonal antibodies: strategy and 
procedures. Meth. Enzymol. 73, part B, 3-46.
3． 小鼠-小鼠B淋巴细胞杂交瘤 见巴德年主编 《当代免疫学技术与应用》pp.352-364. 北京医科大学和协和医科大学联合出版社 1998  

上一页  [1] [2] [3]