6、包埋:
将浸蜡后的材料包埋于石蜡中,并使它凝固成蜡块,这一过程称为包埋。
包埋前,视组织块的大小先将绘图纸折成一纸盒,作为包埋的容器。纸盒折法如下:先折1、2线,次折3、4线,然后使a、b两折重叠,向外折出5线;同法折出6线,再折c线。最后依同法折出7、8线及d线即成。
将纸盒盛满已熔化的石蜡,随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中,应注意切面朝下,位置放正。然后速将纸盒半浸于冷水中,待石蜡表面凝结后,将纸盒全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后,拆去纸盒即成蜡块。
7、切片:
切片前,先将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正方形或长方形,否则切出的
蜡带弯曲不直,或无法连成带状。
将修整后的蜡块粘在小木块上,小木块装在切片机上,以待切片。
在旋转式切片机上将蜡块切成4-8um厚的薄片。切下的薄片连。蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带,放在蜡带盒内备用。
8、贴片或烤片:
将蜡片粘贴在载玻片上即为贴片。用小玻棒蘸取一点蛋白甘油滴于一干净的载玻片上,用手指涂匀,并加几滴蒸馏水于载玻片上。 将蜡带按要求切成适当长度的蜡片,然后用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上,再把载玻片放在展片台上(温度为45℃左右)。蜡片受热后即慢慢展平。待完全展平后,用解剖针将切片位置拨正,倾去载玻片上的余水后,将其放在烤片盒中,置于50℃左右恒温箱内烤干。
9、染色:
染色剂多为水溶液,故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。染色方法众多,以H.E.染色法而言有下列步骤:
⑴、脱蜡:将烤干的切片放入二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)中,各为5min, 以溶去切片上的石蜡。
⑵、复水:是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程,即将二甲苯(Ⅱ)中取出的切片移入无水酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸馏水,各级中停留1-5min。
⑶、染色:
①、将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中5-10min,使细胞核着色。
②、用自来水洗去切片上残余的染液。
③、用1%盐酸酒精分色数分钟。分色时就是褪去细胞质不应着色部分的颜色,而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片,使分色适度。
④、入1%氨水或自来水浸洗,使之蓝化。
⑤、在蒸馏水中浸片刻。
⑥、切片入70%→80%→90%各1-2min。
⑦、入0。5%曙红酒精溶液中染色2-5min,使细胞质着色。
10、脱水:
切片依次入95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→无水酒精(Ⅰ)→无水酒精(Ⅱ),各级中停留1-5min。
11、透明:
切片入1:1无水酒精、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ),各级停留1-5min。
12、封藏:
将切片从二甲苯(Ⅱ)中取出,用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶,然后,用镊子加盖盖玻片。
切片封好后,放在切片托盘上待干燥,即可用不观察。
染色结果:细胞核呈现鲜艳的蓝色,细胞质及细胞间质呈粉红至红色。
(三)、注意事项:
1、制片是一个连续的操作过程,往往要连续几天才能完成,因此,事先一定要制订工作日程计划,应按顺序进行工作。这样可避免和其它工作发生冲突,也不会因前后顺序颠到或超过了规定的时间,给工作带来不必要的损失。
2、制片的各个步骤都是互相关联的,如脱水不彻底就会影响到透明的程度,以至影响蜡块的质量。为此,必须对任何一个步骤,都要细致、严格进行操作。
3、通过本实验可了解到每张切片都是来之不易的,因此,应倍加爱护,不要损坏。


