2．黄瓜无菌苗的培养

精选饱满的黄瓜种子，浸种20～30min后，用0.1% HgCl2表面消毒8～10min，无菌水洗涤4～5次，剥皮，种子接入1/2MS培养基中。置于温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。培养时间约1周。

3．原生质体的分离

取黄瓜无菌苗子叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（60～70rpm），在25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3～ 4ml l3％CPW洗液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸也，轻轻铺于20％蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120％蔗糖溶液)，在1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与13％ CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。

用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm离心2-5分钟，弃上清．用血球计数板调整原生质体密度为10⁵一10⁶/ml（请参考细胞计数）之间。

4．原生质体融合

将1-2滴原生质体混合物（密度分别为10⁵一10⁶/ml）滴入小培养皿，静置8—10分钟。相对方向加入2滴40％的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次即可进行培养：

5．观察

两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合．核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。

6．培养(培养基的配制方法)

将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅层培养，在温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养，经1-2个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。

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