由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体[ 12,13 ]。
然而不管是体外合成siRNA，还是基于载体的siRNA表达系统，其作用在很大程度上受到转染的效率的限制。事实上只有某些细胞系才可被有效转染，而对于原代细胞来说，几乎是不可能的。病毒载体仍然是目前常用的在细胞与整体水平进行基因转移的有效工具。逆转录病毒载体（retroviral vector）能够在哺乳动物细胞系和原代细胞进行稳定有效的基因转移。将人H1启动子克隆并插入逆转录病毒载体，构建了能够表达siRNA的逆转录病毒载体，该载体可以在被感染细胞中启动RNAi，有效抑制基因表达；更为重要的是，它能够整合到靶细胞基因组，长期稳定地抑制基因表达，甚至形成突变的细胞系；而且在原代细胞实现了高效率的基因转移，高滴度的病毒对人原代成纤维细胞感染率在99%以上，导致了靶基因的稳定失活[ 14 ]。慢病毒载体（lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。用慢病毒自我失活（self-inactivation, SIN）载体构建的由H1启动子驱动增强绿色荧光蛋白 ( EGFP ) shRNA表达的载体，可以在2种稳定表达EGFP 的细胞系中有效地使EGFP表达沉默，这种效应起始于感染后3 d，并至少持续至感染后25 d[ 15 ]。新近报道的一种由小鼠U6启动子控制shRNA表达的慢病毒载体 ( pLL3.7 )，在其U6启动子下游紧接多克隆位点（MCS），为RNAi茎环结构序列的插入提供了方便；还可同时表达报告基因EGFP，便于对受感染细胞的观察。载体pLL3.7能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性[16]。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
