关键词：siRNA RNAi 肿瘤治疗 HIV 病毒性肝炎
RNAi （RNA interference，RNAi）是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制，由内源性或外源性dsRNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发。dsRNA 在细胞内被切割成21-25nt 干扰性小RNA（small interfering RNA，siRNA）， siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子，从而导致该基因不表达[1]。RNAi发现仅短短5年的时间，由于其高效性和高度特异性，RNAi 成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段。然而，由于长的dsRNA（38-1000bp）在哺乳动物细胞中产生非特异的基因表达抑制，使得RNAi 技术用于哺乳动物中的研究相对滞后。直至2001年，Tuschl研究组通过采取21 nt siRNA 在哺乳动物细胞中诱导了强有力的特异性RNA干扰作用[3]，这一突破性研究进展开创了人类疾病治疗的新天地，在AIDS、乙肝和丙肝等病毒感染性疾病和肿瘤治疗中的应用研究最为活跃和深入，并取得了令人鼓舞的成果。本文对siRNA的设计、制备，以及在病毒性疾病和肿瘤治疗中的研究进展做一综述。
siRNA的设计、制备
在哺乳动物细胞中引发特异的基因沉默最有效的siRNA是21 nt siRNA[3]，其中19个碱基互补，两边3΄ 端各有2个碱基突出（通常是AA或UU）。基因抑制的有效性关键在于siRNA靶基因序列片段的选择，然而，目前为止人们并不知道mRNA的哪一个部位对siRNA更敏感。通常随机选择3-4个靶位点进行设计siRNA，然后根据体外实验结果，筛选出最为有效的siRNA。考虑到mRNA 5΄ 端非编码区（untranslated regions，UTRs）通常有丰富的调控蛋白结合位点，调控蛋白与目的mRNA UTR区结合后可能会影响RISC复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)与mRNA结合降低抑制效果，通常人们避开此区域设计siRNA，但也有研究者持相反态度。 选出合适的靶序列后要同Genebank中的编码序列进行blast 序列分析是非常必要的，这可以避免与无关的mRNA序列同源[4]。目前有多种在线siRNA设计软件可供使用，详细情况请搜索相关网站（www.dharmacon.com, www.qiagen.com, www.ambion.com, ）。
化学合成法制备siRNA是目前最常用的方法，Dharmacon、QIAGEN 、Ambion等公司均可以提供高质量的化学合成siRNA，但费用昂贵。其他体外制备siRNA的方法还包括体外转录法和Rnase III（如Silencer siRNA Construction Kit，Ambion公司） 或Dicer 酶消化dsRNA法[5]。体外制备的siRNA需要专门的RNA转染试剂将其转到细胞内，在不同细胞内的转染效率存在较大差异，在原代细胞和T淋巴细胞中的转染效率低，转染到细胞内后作用时间较短，不能持久抑制基因表达。针对以上不足，结合过去20多年基因治疗的经验，人们构建了各种siRNA 表达载体或病毒载体，siRNA通过转染到细胞内的DNA模板转录而获得，在细胞内形成发卡结构的小RNA（short hairpin RNA, shRNA）。siRNA病毒载体的应用研究是目前研究的热点。目前RNAi常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体[6，7]。
