上述研究均证明了有限的已知基因RNAi文库在哺乳动物细胞基因功能研究中的可行性，为哺乳动物及其细胞大规模功能基因组学的研究 提供了一个重要的技术。
已知基因RNAi文库存在以下缺陷：a．不是随机RNAi文库，必须知道靶基因的序列，细胞基因的覆盖面窄；b．针对每一个基因必须合成 2条以上寡核苷酸，才能确保从中选出干扰效果较好的；C．需要合成众多的不同siRNA，或构建众多的不同载体；d．所需费用高，筛选的工作 量巨大。
3 哺乳动物细胞随机RNAi文库
随机RNAi文库(random RNAi library)是人工构建的可能针对任何基因的RNAi文库。目前已报道的方法有两种，一是通过化学合成随机 DNA序列的方法，二是通过cDNA酶切并克隆到载体的方法。随机RNAi文库不需要知道靶基因的序列，因此理论上讲可以构成抑制任何基因表达的 干扰文库，克服已知基因RNAi文库细胞基因覆盖面窄的缺陷。该文库同常用的基因表达文库一样，为不同 siRNA载体的混合物，因此易于保存 ，显著地减少了筛选的工作量。
化学合成随机DNA序列构成随机RNAi文库的方法是应用以下原理。在化学合成寡核苷酸时，如果碱基选为N，则DNA合成仪在合成DNA片段 时将随机选择A、T、G、C中的任何一种。19～21 nt的寡核苷酸如果部分或全部选为N时，则形成了众多不同随机序列寡核苷酸的混合物。在进 行互补链合成并克隆到双启动子RNAi载体(见图1的载体)后，就形成了随机RNAi文库。
限制性内切酶Mme I的特点是在DNA识别序列(TCCGAC)下游20～21 bp处切开DNA片段。 Luo等巧妙地应用Mme I的独特特性，设计了将长 cDNA片段酶切为20～2l nt小DNA片段，克隆于siRNA表达载体构成随机RNAi文库的方案，称为SPEED。首先将随机cDNA片段与含Mme I酶切位点发 夹结构的DNA接头(linker)连接，再用 Mme I消化，获得20～21 bp与接头连接的cDNA小片段。将形成的双链DNA打开成单链，合成互补链，形成 方向相对的两个小片段cDNA的拷贝，中间为不配对的形成发夹结构的DNA序列。再克隆到反转录病毒载体中，构成随机RNAi文库。利用小鼠胚胎 cDNA文库，他们建立了含3×106克隆、可以抑制众多不同基因的随机RNAi文库，证明该方法的可行性。
Shirane等应用同Luo等基本相同的思路独立地设计了构建随机RNAi文库的方法，称为 EPRIL。应用鼠源FL5.12细胞的cDNA文库，他们建 立了随机RNAi文库。对240个不同克隆的随机测序发现，215个克隆含有正确的能表达siRNA的 DNA片段。BLAST分析显示，165个克隆的插入片段 与己知基因或EST的顺序相吻合，绝大多数分属不同的基因。这一结果说明，EPRIL可以用于复杂基因的随机RNAi文库的构建。
Sen等独立地设计了相似的建库方案，称为 REGS(restriction enzyme-generated siRNA)。为了测试该技术的效果，他们检测了对转基 因和内源基因的作用。实验证明，用该技术制备的RNAi文库可以有效地抑制GFP、Oct-3／4和MyoD的表达。他们应用该方案从混合cDNA构建了含 4×105克隆的随机RNAi文库。
虽然RNAi文库的构建和应用还存在一些问题需要克服，但该技术已经在大规模基因功能筛选和研究中显示出广阔的应用前景。它的成功 应用将有希望极大地促进基因功能方面的研究。
