2 哺乳动物细胞已知基因RNAi文库
哺乳动物细胞已知基因RNAi文库构建的方法如下：首先选定靶基因，根据靶基因的DNA序列和siRNA设计原则，合成siRNA，或合成寡核 苷酸序列并克隆到表达载体，或用PCR的方法扩增为siRNA表达盒。众多针对不同基因的siRNA或 siRNA表达载体或表达盒即构成有限的RNAi文库 。应用该文库转染哺乳动物细胞可以特异地抑制不同基因的表达，通过表型的筛选来发现功能基因，如信号转导通路新分子的筛选、与肿瘤细 胞存活或转移相关基因的筛选等。
Aza-Blanc等应用Dharmacon公司生产的针对510个基因(包括了大多数激酶基因)的siRNA文库，通过转染HeLa细胞筛选了对TRAIL诱导细 胞凋亡有调控作用的基因。TRAIL是TNF家族的一员，具有抗肿瘤的功能。实验证明，TRAIL蛋白能同DR4和DR5受体结合，诱导多种肿瘤细胞的凋 亡，而对正常细胞没有影响。Aza-Blanc等的筛选既发现了一些能增强TRAIL诱导细胞凋亡的基因，也发现了一些具有抑制作用的基因。这些基因包括以前已知对TRAIL功能有调控作用的基因如 GSK30α和SRP72，也包括一些未知的调控 基因如 DOBI、MIRSA等，对了解TRAIL的作用机制和抗肿瘤药物的开发有重要的意义。
Berns等构建了针对7914个基因的人RNAi文库。他们应用了shRNA(short hairpin RNA)反转录病毒载体，每一个基因构建了3个不同的 shRNA载体，共有23742个不同的载体。用该 RNAi文库进行基因功能的筛选，发现了1个已知、5个未知的在p53依赖的增殖阻滞中起调控作用的 基因。进一步的研究证明，抑制这些基因的表达导致细胞对p53和p19ARF依赖的增殖阻滞以及对 DNA破坏诱导的G1细胞周期阻滞均 不敏感。 Paddison等应用shRNA病毒载体，构建了针对9610个人基因和5563个小鼠基因的shRNA表达文库。在26S蛋白酶系统的功能基因筛选中 ，证实该RNAi文库的实用性和可靠性。
Zheng等构建了一个双启动子载体pDual。该载体包含两个方向相对的聚合酶Ⅲ启动子，分别为小鼠的U6启动子和人的H1启动子，中间插 入能转录siRNA的DNA序列(图1)。该载体的优点是，正义和反义RNA从同一DNA序列转录，减少了合成DNA序列的长度，降低了费用和工作量。他 们巧妙地设计了能用PCR扩增的含双启动子的 siRNA表达盒，并证实可以在哺乳动物细胞有效地抑制基因的表达。应用这一技术，他们构建了针 对8000个基因的siRNA表达盒，在大规模的功能基因筛选中发现了一些已知和未知的在NF-KB信号转导通路中起重要作用的基因。
Silva等将siRNA和siRNA表达载体与转染试剂混合后以微阵列的形式点在细胞培养板上，可以转染在板上生长并与之接触的活细胞。该 技术为应用RNAi文库进行细胞的基因功能筛选提供了一个简单有效的方法。
