5.2.2 体外酶法合成
与化学合成相比体外酶法合成要经济得多, 此法需首先合成两段29nt 的DNA , 包括8 个与T7启动子3'端互补的碱基(称为引导序列, leadersequence) 和由21 个碱基构成的siRNA 编码序列。将这两段DNA 分别和T7 启动子混合, T7 启动子和DNA 引导序列退火结合, 然后用DNA 聚合酶Klenow 大片断补齐成为可用于转录的双链DNA 模板, 分别用T7 RNA 聚合酶进行体外转录, 再将产物混合形成dsRNA。新的双链RNA 包含5'端单链的引导序列和中间互补的19 个碱基序列以及3'端两个重复的U (UU) , 以DNA 酶降解模板,同时用单链专一的核糖核酸酶(RNase) 消化5'的引导序列, 由于RNase 不能切开U 碱基也不能降解双链RNA , 所以得到的产物就是所需的21bp的双链siRNA ---有19 对碱基互补, 3'端各有2个U 突出。用酶法合成的siRNA 比化学合成的同序列siRNA 活性高20倍, 估计可能是由于siRNA 纯度的差异造成的结果。
5.2.3 体内转录
最近有几个研究小组构建了一些可以在真核细胞内表达siRNA 的载体, 包括被广泛应用的质粒载体和新研发的转染效率较高的病毒载体。质粒载体都包含有一个RNA 聚合酶Ⅲ( PolⅢ) 启动子和一个4～5 个连续的T 构成的转录终止位点以及选择标记, 选用Pol Ⅲ启动子是因为此启动子总是在距其一定距离的位置起始转录, 而遇到4～5 个连续的T 就终止转录, 并且终止于转录终止位点第二个碱基处, 十分精确。此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和反义链的模板, 正义与反义序列之间由一段环(loop) 序列隔开(图2A) , 插入载体Pol Ⅲ启动子下游, 然后转入细胞,环序列可使转录出的RNA 链折叠成具发夹结构的小RNA 分子(图2C) , 这些小RNA 可被细胞内的Dicer 切割为长21bp 的siRNA ---有19 对互补碱基, 3'端各有2 个U 突出, 可引起特定基因沉默。与化学合成及体外酶法合成相比, 表达载体是在细胞内通过转录持续产生siRNA , 所以可延长siRNA 作用时间, 目前此法已被广泛应用。
5.3 siRNA 导入细胞的方法
在体外(in vit ro) 可用不同的方法将siRNA导入靶细胞, 一般来讲化学合成和体外酶法合成的siRNA 可用电转移(elect roporation) 、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通过转染的方法导入靶细胞然后再表达siRNA。向体内(in vivo) 导入siRNA 的研究工作也已有报道, 如有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA 引入动物体内进行基因功能的研究。但这些方法所产生的抑制效应都是很短暂的, 一般有效期只有一周左右。最近Abbas等利用改造后的病毒载体转染哺乳动物细胞, 发现在细胞内的抑制效应可持续25 天左右, 进一步促进了RNAi 技术的应用。
6. 结语
虽然人们对RNAi 的研究只有短短的几年时间, 但进展却极为迅速。这种奇特的生物学现象使人们不得不对RNA 在生命活动中的作用进行重新认识。可以认为RNAi 是一个以小分子RNA 为中心的真核细胞基因表达调控系统, 它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化, 通过对RNAi的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。同时, RNAi 技术为人们更迅速、更准确的剖析基因的功能, 分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具。而且它还为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路, RNAi 技术必将为生命科学研究和临床治疗带来新的革命。
