4 RNAi 技术的应用
        虽然对RNAi 的研究只有短短几年时间, 但RNAi 技术已经快速被应用于多个领域。
4.1 基因功能研究
        随着人类基因组计划的提前完成, 科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi 技术已成为解决这些问题的重要手段。与其他方法相比,RNAi 技术在基因功能研究上有其独特的优点:①简单易行, 容易开展; ②与基因敲除( geneknockout) 相比实验周期短, 成本低; ③与反义技术相比具有高度特异性和高效性; ④可进行高通量(high throughout) 基因功能分析。RNAi 技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法, 如Harbth 等应用RNAi 技术发现有13 个基因对哺乳动物培养细胞的生长和分化必不可少。最近Maeda 等利用高通量RNAi 技术对线虫的大约10000 多个基因进行了功能分析, 取得了理想的效果。总之, 随着后基因组学时代的到来,RNAi 技术将会成为功能基因组学研究的主要方法。
412 临床应用
        前已述及, RNAi 机制可作为真核生物的基因组免疫系统, 抑制外源和内源有害基因的表达。人类目前对病毒(如HIV) 所致疾病缺乏理想的治疗方法, 如果利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会抑制病毒的增殖,这为病毒相关疾病的治疗提供了新的思路, 最近Song等利用RNAi 技术在病毒性肝炎的治疗方面取得了很好的效果。另外, 利用RNAi 技术还可以高效、特异、快速的抑制细胞内癌基因的表达,人类的许多癌症是由于少数癌基因超表达导致细胞过度增殖所致, 如果利用RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。Yin 等利用人类皮肤癌细胞作为模型, 将一组与癌基因具同源性的siRNA 引入人黑素瘤细胞,结果发现癌细胞的异常增殖被显著抑制。最近Brummelkamp 等开发的一种质粒系统(pSUPER) 可以使siRNA 在哺乳动物细胞内长时间稳定表达, 这为抗癌药物开发和应用开辟了新的途径。可以预测, RNAi 技术将会很快应用于癌症和病毒疾病的治疗, 并可能会为这些疾病治疗带来突破。
5 RNAi 技术要点
5.1 siRNA 的设计
        以前人们一般应用较长的dsRNA 作为基因沉默的工具, 但后来发现长链dsRNA 特异性较差。它可激活RNaseL 导致非特异性RNA 降解, 还能激活依赖于dsRNA 的蛋白激酶R (protein kinaseR , PKR) , PKR 可磷酸化翻译起始因子e IF2a 并使其失活, 从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp 的dsRNA 就可以有效引起基因沉默,并且不会产生非特异抑制现象, 进一步研究表明抑制作用最强的是长21bp 、3'端有两个碱基突出的siRNA。但RNAi 技术要求siRNA 反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对, 单个碱基错配就会大大降低沉默效应, 而且siRNA 还可以造成与其具同源性的其它基因沉默(也叫交叉沉默) , 所以在siRNA 的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA 只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。设计siRNA 序列应注意以下几点: ①从靶基因转录本起始密码子AU G 开始, 向下游寻找AA 双核苷酸序列, 将此双核苷酸序列和其下游相邻19 个核苷酸作为siRNA 序列设计模板; ②每个基因选择4～5 个siRNA 序列, 然后运用生物信息学方法进行同源性比较, 剔除与其他基因有同源性的序列, 选出一个特异性最强的siRNA; ③尽量不要以mRNA 的5'端和3'端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板, 因为这些区域有许多调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物) , 调节蛋白会与RISC 竞争结合靶序列, 降低siRNA 的基因沉默效应。
5.2 siRNA 的合成
        目前获得siRNA 主要有三种方法, 化学合成、体外酶法合成和体内转录。
5.2.1 化学合成
        siRNA 可以直接进行化学合成, 方便且不受碱基限制, 但合成一个siRNA 需先分别合成两条单链(每条链合成需20 步反应, 每步反应产物均需纯化) , 然后再退火成双链RNA , 合成耗时长且费用很高。

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] 下一页