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特殊组织DNA的提取及鉴定
作者:佚名 来源:本站原创 时间:2005-8-4

    1、提取DNA的简易方法:
    1)、从全血中提取DNA:取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中,加500μl左右的ddH2O混匀后,12000rpm离心2分钟,弃上清,(若沉淀中仍 有红细胞,需重复此操作1-2次)加入样品提取液20μl,混匀,100℃煮10分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟,取上清2μl进行扩增。
    2)、从其它有核细胞中提取DNA:可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精子、组织碎片等有核细胞的管中,100℃煮10分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟,取上清进行扩增。
    2、从全血中用有机溶剂提取DNA:
    1)试剂
    a.10%SDS
    b.2.0M醋酸钠
    c.20mg/ml蛋白酶K
    d.苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)
    e.分析纯乙醇
    f.TE(10mM Tris,1.0mMEDTA溶液,Ph7.5)
    2)步骤
    A、血液样本收集于含EDTA的抽血用管子中,样品用手倒转试管混合后等分。每份700μl全血可放在1.5ml的塑料离心管中,-70℃储存。
    B、在解冻的(或液体的)血液中加入800μl的TE并混匀,12000rpm离心2分钟。
    C、吸取1.0ml上清液并弃去。
    D、加入1.0mlTE,振荡后离心2分钟,去除尽可能多的上清液,但不要影响沉淀。
    E、向沉淀中加入:375μl 2M醋酸钠; 25μl 10%SDS;5μl 蛋白酶K溶液。略加振荡,于56℃保温一小时。
    F、加入120μl苯酚/氯仿/异戊醇,振荡30秒。
    G、12000rpm离心5分钟。
    H、小心移出水相(上层)到一新的1.5ml的离心管中。
    I、向水相中加入2.5倍体积预冷的分析纯乙醇,倒转试管加以混合,将试管于-20℃下放置10分钟以上。
    J、12000rpm离心10分钟。
    K、倾去酒精,用移液器小心吸去剩余酒精,不要触动沉淀。
    L、加180μl TE 后振荡。加20μl2M醋酸盐,手工混匀。
    M、加500μl预冷分析纯酒精,用手轻轻混匀,12000rpm离心10分钟,倾去上清液。
    N、用室温下的70%酒精1ml洗涤DNA沉淀,12000rpm离心5分钟,倾去上清液。
    O、用移液器吸去残余的酒精,管子置于真空离心抽除残余的酒精(大约10分钟)。或将管子放在100℃以下烘干。
    P、加200μl TE于DNA沉淀中,混匀后于4℃保温过夜(或56℃溶解DNA 2小时以上),次日清晨振荡10秒。
    3、从斑痕材料中用有机溶剂提取DNA
    1)试剂
    a.斑痕抽提缓冲液(1.21g Tris,5.84gNaCl,6.02g二硫苏糖醇,   2%SDS,10mMEDTA/升,Ph8.0)
    b.其它试剂见2.1)
    2)步骤
    A、将斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料离心管中。
    B、加400μl斑痕抽提缓冲液及10μl蛋白酶K溶液,混匀,离心数
    秒使碎片浸入液体。
    C、于56℃保温过夜。
    D、用一新的灭菌牙签将碎片中的液体拧干后从管中取出。
    E、加500μl苯酚/氯仿/异戊醇,手摇混匀,12000rpm离心3钟。
    F、将上清液转移到新的离心管。
    G、上清液中加入2.5倍体积预冷的分析纯酒精。
    H、手摇混匀试管中的各种成分,放置-20℃10分钟以上。
    I、12000rpm离心10分钟。
    J、倾去酒精。
    K、用1ml室温的70%酒精洗涤。
    L、12000rpm离心5分钟。
    M、倾去酒精,用移液器吸去残余酒精。
    N、真空离心10分钟除去残余酒精,或在100℃以下烘干.
    O、56℃下用36μl TE溶解DNA,时间至少2小时。
    4、从精斑中分离提取DNA
    1)试剂
    a.TNE缓冲液(1.21g Tris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升)
    b.20%sarcosyl
    c.0.39M二硫苏糖醇
    d.其它试剂见2.1)

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