表18-1 探针标记及特性
| 标记物 | 检测方法 | 特点 |
| 32P | β射线，自显影 | 灵敏度最高，半寿期14天，放射强度1.7MeV |
| 35S | β射线，自显影 | 灵敏度高，分辨率好，半寿期87天，0.17MeV |
| 3H | β射线，自显影 | 低敏度高，分辨率高，半寿期12年，0.01MeV |
| 125I | γ射线，自显影 | 灵敏度高，分辨率高，半寿期60天，0.04MeV |
| 生物素 | 酶标血凝素，显色 | 灵敏度好，避免有内源性生物素标本 |
| 地高辛 | 酶标地高辛配体，显色 | 灵敏度好，分辨率一般 |
| T-T二聚体 | 酶标抗二聚体抗体，显色 | 灵敏度好，紫外照射形成二聚体而标记 |
| BrdU | 酶标抗BrdU抗体，显色 | 灵敏度好，细菌内含质粒复制掺入 |
| 铕-补骨脂素 | 荧光 | 灵敏度一般 |
缺口平移标记法先由DNase Ⅰ在DNA双链上切出随机切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。（图18-4、5）
缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA的功能，用于大分子DNA标记（＞1000bp最好），单链DNA、RNA不能用该法标记。随机引物法具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但不能标记环状DNA。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，用于大分子核酸标记因尾巴短而标记比活性降低。尾标不能用dTTP标记，因mRNA的多聚（A）尾而影响杂交特异性。寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变检测，该探针可用核酸合成仪人工合成。克隆探针一般较长，特异性
图18-5 DNA随机引物标记法
好，标记量大，杂交检出信号强。合成探针长度短，一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意碱基组成G≡C含40％-60％，一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构，影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外，还有利用M13噬菌体载体可复制单链DNA的特点，复制合成DNA探针，利用转录载体（DNA），转录合成RNA探针。下面就GIBCo BRL公司（Bethesda Research Laboratories美国）的缺口平移法标记生物素试剂盒（bionick labeling system）为例介绍如下：
| 试剂： | 10x dNTP Mix.250μl | 10x Enzyme Mix 250μl |
| 0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP | 0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ | |
| 0.1mmol/L dATP | 0.0075 units/μl DNase Ⅰ | |
| 0.1mmol/L biotin-14-dATP | 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5) | |
| 500mmol/L Tris-HCl(pH7.8) | 5mmol/L magnesium acetate | |
| 50mmol/L MgCl2 | 1mmol/L β-mercaptoethanol | |
| 100mmol/L β-mercaptoethanol | 0.1mmol/L phenylmethyl- | |
| sulfonyl fluoride | ||
| 100μg/ml nuclease-free BSA | 50％（v/v）glycerol | |
| 100μg/ml nuclease-free BSA | ||
| Control DNA：5μg pBR322 in TE | ||
| stop buffer 300 mM EDTA | ||
| autoclaved H2O |
操作步骤：
将5μl 10x dNTP Mix.；－μl DNA（相当1μg需标记的DNA量）；－μl灭菌蒸馏水加至45μl；再加5μl 10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml离心管后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。乙醇沉淀，备用。
