4．电泳和放射自显影
(1）配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。
(2）预电泳30min。
(3）每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中，加5μl loading
buffer，混匀，离心，置94℃变性2min。立即置冰浴。
(4)停止预电泳，冲洗加样孔。
(5)加样2μl。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。
(6）下胶：（同测序胶）
(7）干胶：在胶表面覆上保鲜膜，80℃干胶30min。
(8)X光片-70℃曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。
图2-6显示了dd-PCR放射自显影的X光片
5．差异条带回收再扩增
(1）X光片经D72显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。
(1) 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2O 20μl，沸水浴15min，离心取上清为模板。
(3) 以原引物扩增：
回收DNA 7 μl
10×PCR buffer 5 μl
5mM dNTPmix 0.5 μl
引物P 2.5 μl
引物T 2.5 μl
Taq酶 2 μl
加ddH2O至总体积为50μl
(4) 执行PCR程序:
93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循环；68℃5min。
(5) 取PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。
(6) PCR产物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。
6．以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。
7．PCR产物的TA克隆。
8．DNA序列测定。
9．检索分析。
