以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因
序列及cDNA文库中的全长cDNA序列
基因功能的鉴定：
①knock out
②dominant negative mutation
③原核系统或真核系统中的表达翻译。抗体的制
备，细胞内的定位，抗体抑活等等。
④one hybrid判断出该基因的“启动”基因。
⑤two hybrid判断出该基因的产物的作用途径。
这里以CLONTECH公司生产的DeltaTM Differential Display Kit为例，介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。
二、 操作步骤
1．总RNA的提取（见Northern 杂交）
2．第一链合成：
(1)总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。
(2)混匀后稍离心。
(3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。
(4）准备dNTP mix (以5管为例 )
每管 5管
5×第一链缓冲液 2μl 10μl
dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl
MMLV逆转录酶（200u/μl） 1μl 5μl
5μl 25μl
(5）每管加入5μl，混匀后稍离心。
(6）42℃孵育1hr。
(7）75℃ 10min终止反应后置冰上，稍离心。
(8)将2μl反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B等）。
(9) 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。
(10)将72μl ddH2O分别加入A管中，混匀。
(11）将所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。
3．dd-PCR: 以 引物P1,T9为例说明
（0.5ml PCR管,1代表对照组,2代表实验组）
管号 cDNA样品 引物
(1) 1A P1,T9
(2) 1B P1,T9
(3) 2A P1,T9
(4) 2B P1,T9
(5) H2O P1,T9
(6) RNA1 P1,T9
(7) RNA2 P1,T9
以下为阳性对照反应体系
(8) PC 1A P10,T8
(9) PC 1B P10,T8
(10) PC 2A P10,T8
(11) PC 2B P10,T8
(12) H2O P10,T8
(13) PC RNA1 P10,T8
(14) PC RNA2 P10,T8
在PCR 管中加入:
① cDNA样品 1μl
P引物 1μl
T 引物 1μl
② 准备其它 PCR试剂的混合液: (在另一管中加入)
成分 每管(μl) 所需管数( n=14)
10×buffer 2.0 2n
ddH2O 14.0 14n
dNTPmix 0.2 0.2n
α-32P dATP 0.4 0.4n
Taq酶 0.4 0.4n
终体积 17.0 17 n
混匀后稍离心。
③ 将17μlPCR混合液加入各反应管，则各管总体积为20μl。
④ 开始PCR扩增。
⑤ PCR循环参数：
在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序：
94℃ 5min
1 cycles 40℃ 5min
68℃ 5min
94℃ 30sec
2 cycles 40℃ 30sec
68℃ 5min
94℃ 20sec
23 cycles 40℃ 30sec
68℃ 2min
1 cycles 68℃ 7 min。
⑥ 反应结束后置-20℃保存备用。
