3. 样品制备：取总RNA4.5μl(约20-30μg) ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。
4. 电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。
5. 将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：
(1) 按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。
(2)将胶块切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。
(3)用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。
(4)将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
(5)用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。
(6) 在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。
(7) 将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。
(8) 将一叠（5-8cm厚）略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。
7.转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上残留的凝胶。
8.将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。
10. 探针标记(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
（1） 取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
（3）将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1hr。
11.预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3hr。
12.杂交：将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加入到预杂交液中，42℃杂交16hr。
13.洗膜：
(1)倾去杂交液。
(2)2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。
(3)0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。
14.压片：将膜用dd H2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影3～7天左右。
三、注意事项
1．操作时必须仔细、小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。
2．必要时，可采用Sephades G-50柱层析法纯化标记的探针（见本节附录），以去除标记反应中未结合的（游离的）核苷酸。
3．膜的重复使用：结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下：杂交的膜（注意：杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合）置 100℃ 0.5% SDS中煮沸3min，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。
RNA酶保护试验
RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：
1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。
2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。
3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。
5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。
6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。
7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。
RPA的缺点是需要同位素标记探针。
