(2) 依赖特征序列的方法是依据转录子内部及其两侧的序列特征直接从基因组DNA中分离cDNA片段，主要有CpG岛搜寻法、外显子捕获法(exon trapping)、交叉物种序列同源性比较法(cross-species sequence homology)、Alu PCR法与直接序列分析法等。CpG岛也称为HTF岛，是一些富含GC的小区域。大部分转录子的附近(通常是在5′上游区域)都含有非甲基化的CpG岛［9］。利用一些识别CpG岛的稀有酶，如SacⅡ、BssHⅡ、EagⅠ等，切割基因组DNA，获得位于CpG岛附近的序列作为探针从总RNA或cDNA文库中得到转录子。外显子捕获法是基于对外显子两侧的功能性5′和3′剪接位点的识别，从基因组DNA中分离外显子片段［10］。交叉物种序列同源性比较的依据是编码区序列在不同物种间的保守性要远高于非编码区［11］，把候选区域的DNA分为多个亚克隆，分别与不同的物种总DNA杂交，与不同物种DNA都有阳性信号的DNA克隆可能就是编码区基因。这种方法依赖的是物种间DNA水平上的序列同源性。Alu序列是散布于人基因组中的短的重复序列，通过设计人特异的Alu序列作为引物，可直接快速用PCR方法从YAC、BAC、PAC克隆或人鼠杂合细胞中得到人源的特异序列［12］。直接序列分析法则在基因组序列信息中用GRAIL和GeneScan等软件分析推测编码基因的方法［13］。
　　(3) 表达依赖法，也即Northern杂交分析法［14］。用候选区域基因组DNA作为探针与总RNA杂交，切下阳性条带，反转录为cDNA并克隆，即可获得位于此基因组片段中的转录子。
　　上述方法都各有其优缺点，必须根据原材料及要达到的目的，选择适当的一种或多种方法组合来达到研究目的。此外，其它方法还很多，如微切割和微克隆法、减法cDNA杂交法、重组筛选法等。
　　3.全长及功能分析
　　获得了众多的候选cDNA后，通过筛选cDNA文库或RACE等方法克隆全长基因。为确定其中的致病基因，需要逐个检测它们在患病家系中的变化情况，并分析其功能。功能分析往往是定位克隆中的一个难点，因为不同的疾病有不同的特征，也就需要用不同的功能检测系统进行分析。常用的如细胞水平的正义或反义基因的表达后细胞形态和功能变化的研究，在肿瘤研究中检测细胞形态和接触抑制的变化，软琼脂生长能力的变化及裸鼠致瘤性分析等。更进一步的功能分析则包括个体水平的基因敲除实验等。
　　现在还发展出了一些与其它方法相结合的新思路，如与差减杂交相结合，筛选位于候选区域的差异表达基因，大大提高了获得有价值基因的可能性。同时人类基因组计划中转录图谱［15］工作的开展，有很多EST已被精确定位于染色体的不同区带上，可以直接进行功能研究。随着研究的深入，越来越多的EST定位工作的完成，基因转录图谱的不断完善，我们完全可以直接跳过定位克隆的第二个步骤而直接进入功能鉴定和基因全长的克隆工作，这可能将是定位克隆中最快的方法。在分析分离手段不断提高，人类基因组计划紧锣密鼓地实施的今天，各种新思路新方法层出不穷，定位克隆方法的周期也将不断缩小，为人类最终克隆各种疾病基因提供了可能性。
　　参考文献
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