配制方法:
(1)贮存液A(0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4):称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中,得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液,然后加入Na2HPO4至0.1mol/L,将pH调至7.4,补足0.1mol/L的PB至100ml,使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存,最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
(2)贮存液B(8%多聚甲醛溶液):称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中,配成8%多聚甲醛液(方法见前)。过滤后4℃冰箱保存。
(3)临用前,以3份A液与1份B液混合,再加入结晶过碘酸钠(NaIO4),使NaIO4终浓度为2%。由于AB两液混合,pH从约7.5降至6.2,故固定时不需再调pH值。固定时间为6~18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基,通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合,从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成,抗原决定簇位于蛋白部分,故该固定剂有选择性地使糖类固定,这样既稳定了抗原,又不影响其在组织中的位置关系。Mclean和Nakane等认为,最佳的混合是:含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6.Karnovsky’s液(pH7.3)
试剂:多聚甲醛 30g
25%戊二醛 80ml
0.1mol/L PB 至1000ml
配制方法:先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中,再加入戊二醛,最后加0.1mol/L的PB至1000ml,混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学,用该固定液在4℃短时固定,比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定,接着浸泡固定10~30min,用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7.0.4% 对苯醌 (Parabenzoquinone)
试剂:对苯醌 4.0g
0.01mol/L PBS 1 000ml
配制方法:称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用,但对超微结构的保存有一定影响,故常与醛类固定剂混合使用。一般要求临用前配制,且避免加热助溶,因加热或放置时间过长,固定液变为棕色至褐色,会使组织标本背景增加,影响观察。此外,对苯醌有剧毒,使用时避免吸入或与皮肤接触。
8.PFG液(Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG)
试剂:对苯醌 20g
多聚甲醛 15g
25%戊二醛 40ml
0.1mol/L二甲酸钠缓冲液 至1000ml
配制方法:先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛,然后加入戊二醛,最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用,即可阻止醛基对抗原的损害,又不影响超微结构的保存,故适于多种类抗原的免疫细胞化学,尤其是免疫电镜的研究。
9.碳二亚酰胺-戊二醛(ECD-G)液
试剂:0.05mol/L PB 500ml
0.01mol/L PBS 500ml
Tris 约14g
浓HCl 少许
ECD 10g
25%戊二醛 3.5ml


