(6)　在室温下融合:
　　①　30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。
　　②　作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
　　③　加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
　　(7)　离心，800rpm，6分钟。
　　(8)　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
　　(9)　根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
　　(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
　　一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
　　(二)　HAT选择杂交瘤
　　应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。
　　一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。
　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。
　　50×HAT
　　H:　5×10-3M
　　A:　2×10-5M
　　T:　8×10-4M
　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
　　三、抗体的检测
　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
　　常用的方法有:
　　1.　ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。
　　2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
　　3.　FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
　　4.　IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
　　上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。
　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
　　四、杂交瘤的克隆化和冻存
　　克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
　　(一)　克隆化方案
　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
　　1.　有限稀释法的程序
　　①　制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
　　②　阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
　　③　取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
　　④　培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。
　　⑤　第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
　　注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
　　2.　软琼脂法
　　①　软琼脂的配制
　　含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640
　　1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
　　0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
　　②　用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
　　③　按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
　　④　1ml 0.5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
　　⑤　混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
　　⑥　4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
　　⑦　检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。

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