2.2 双链RNA的构建 双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al [9]用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA[10]. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶[11]. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al [12]用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.
3 RNAi的应用
3.1 高通量研究基因功能 基因功能研究现在已经明确，双链RNAi干扰(RNAi)技术不仅可抑制体外细胞中特定基因的表达，而且也可抑制体内特定基因的表达. 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能. 21nt siRNA的双链复合物在哺乳动物细胞中干扰成功为基因作用的研究提供了一种新的工具，原来要花费 6mo-1 a才能明确一个哺乳动物细胞基因如何关闭，现在只需一个星期就能明确10个基因的关闭，使工作进程大大加快. 可以预见，RNAi作为一种快速静默基因的途径，将会越来越多地用于哺乳动物基因研究. 将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达. 这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干扰，使目的基因静默，从而进一步研究目的基因的功能. 根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi[13]. 线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究[14].
3.2 研究信号转导通路的新工具 由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，他成为研究信号传导通路的良好工具. 在线虫体内，胰岛素和受体结合后可以活化Dsor1，他是Mek的类似物，Dsor1活化后可以激活EekA，他是ERK的类似物. 用以Dsor1为靶目标的dsRNA可以阻断Dsor1的表达，虽然总的ErkA的表达不受影响，但由于Dsor1的表达被抑制，因而胰岛素刺激后ErkA不能活化[15].
3.3 基因治疗的新方法 用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾病和恶性肿瘤等疑难病症. 而肿瘤是多基因、多因素疾病，单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果. 但RNAi技术能够同时抑制多个不同基因，而且抑制效果互不干扰. 此外，RNAi识别可以精确到一个核苷酸，对由野生型点突变形成的癌基因，如ras，p53等，能够产生准确有效的封闭效果，野生型基因则不受影响. 实验证明，bcl-2，CDK-2，PLK-1和p53等肿瘤相关基因的RNAi，能够使人类宫颈癌细胞(HeLa)增生速度减慢，恶性程度降低，凋亡加快. 肝癌(Hep3B)、非小细胞肺癌(H1299)、头颈部鳞状细胞癌(C33-A)、骨肉瘤(U-2OS)及前列腺癌(LNCaP)[16]、白血病[14]等细胞系中的实验也发现类似效应. 此外，将RNAi应用于Wilson病等先天遗传性疾病的体外实验也获得令人满意的结果[17-25]. 2002-09，科学家采用这项技术完全清除了生长在试管中的所有癌细胞，而未伤及正常细胞. 随着这一研究结果近日的公布，另一个小组的研究人员正设计这一技术在世界上的第一次临床试验，将在一组艾滋病患者中进行. 由于双链RNA干涉，通过使有害的基因“静默”而奏效，因而科学家认为，可用其来静默感染的病毒基因或已转为恶性的肿瘤细胞，从而使他们变得无害.
总之，科学家预言，一旦RNAi技术能用于临床治疗艾滋病、肝炎和恶性肿瘤，这将是病毒性、寄生病原性、突变基因和癌基因表达等所引起的疾病在基因治疗方面的一场新的革命. 而基因的突变在胰腺癌的发病及发展中均占有重要地位，通过改变癌基因的表达，可以杀灭肿瘤或抑制肿瘤生长或增加癌细胞对化疗药物的敏感性，RNAi将会是胰腺癌基因治疗的又一重要工具.
任玥欣, 宋于刚, 陈学清. RNAi研究进展. 世界华人消化杂志 2004;12(3):748-750
