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常用的分子生物学基本技术
作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-7-9

    寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotide microarray hybridization)

    是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面,与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交,以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征,或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。

    液相杂交(solution hbridization)

    指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链(探针)在溶液中保温,使之形成杂交复合物。反应结束后,用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开,然后结膈后在杂妆分子中的探针量,就可推算出被测的核酸量。

    递减杂交(subtractive hybridizatio)

    是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA(或逆转录成的cDNA),在一定的条件下以过量的驱动mRNA或cDNA与测试的单链cDNA或mRNA进行液相杂交,通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之间相同的基因成分,保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选cDNA文库,可获得特异表达的目的基因cDNA全长序列。

    核酸原位杂交

    用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其实行检测的方法,称为核酸原位杂交(nucleic acid hybridization in situ)。用来检测DNA在细胞核或染色休上的分布,与细胞内RNA进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰;还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。

    该法的优点是特异性高,可精确定位;能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响;不需要从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性;并可完整地保持组织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学生物学的研究,如基因定位、基因制失,基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。近年来由定性发展到定量,方法更为完善。

    DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)

    在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接,转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括:制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接,制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体(vecors)在细胞内自我复制,并带动重组的分子片段共同增殖,从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝,有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆,就可以深入分析基因的结构与功能,随着引入的DNA片段不同,有两种DNA库,一种是基因组文库(genomic library),另一种是cDNA库。

    载体 所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

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