三、 末端标记DNA探针
现以Klenow片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。
1、材料：待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。
2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。
3、试剂：
(1)3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。
(2)合适的限制酶。
(3)[α-32 P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow片段(5U/ml)。
(5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。
4、操作步骤：
(1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。
(2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种dNTP 1ml [α-32 P]-dNTP 适量 加水至 50ml
(3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15分钟。
(5)70℃加热5分钟,终止反应。
(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。
[注意]
1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。
2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。
3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。
四、寡核苷酸探针
利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。
1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/μl)。
2、设备：高速离式离心机，恒温水浴锅等。
3、试剂：
(1)10×T4多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1mmol/L Spermidine·HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。
(3)T4多核苷酸激酶（10单位/ml）。
4、操作步骤：
(1)100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃变性5分钟，迅速置冰溶中。
(2)立即加入下列试剂：
10×激酶缓冲液 5ml
[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml
T4多核苷酸激酶 2ml
加水至 50ml
混匀后置37℃水浴20分钟。
(3)再加入20单位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分钟后立即置冰浴中。
(4)Sephadex G-50柱层析。
此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。
除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。
