操作步骤：
(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：
单链模板（约0.5pmol） 1mg
适当引物 5pmol
10×Klenow缓冲液 3ml
加水至 20ml
(2)将eppendorf管加热到85℃ 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；
(3)依次加入：
DTT 2ml
[α-32 P]dATP 5ml
未标记的dATP 1ml
dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml
混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。
(4)加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。
(5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。
(6)68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。
(7)加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小时。
(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。
(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。
2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料：已提纯的RNA或mRNA
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [α-32 P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反转录酶(200000单位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
(6)250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40单位/ml)。
操作步骤:
(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：
RNA或mRNA 10.0ml
合适的产物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[α-32 P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至 48ml
反转录酶(200000单位/ml) 2ml
混匀后,稍稍离心，37℃保温2小时。
(2) 反应完毕后加入下列试剂： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保温30分钟以水解RNA。
(4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 [注意] RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。
