guohui

HBcAg 基因在甲醇型酵母中的表达、产物纯化
及其性质的初步研究
陈　恒1 ,2 ,4 3
　黄亚红3 ,4 　梁婉琪4 　张惟杰1
(1 上海交通大学生命科学技术学院　上海　200030 　　2 上海大学生命科学学院　上海　200436
3 南京大学生物科学与技术系　南京　210093 　　4 上海市农业科学研究院生物技术中心　上海　201106)
摘要　为研究乙肝核心抗原蛋白(HBcAg) 在甲醇型酵母( Pichia Pastoris) 中的表达和性质,用PCR
方法将HBcAg 基因(L) 克隆到P. Pastoris 胞内表达载体pPIC3k 中,并利用电击和同源重组法,将
重组质粒pPIC3k2L 转化感受态的甲醇型GS115 酵母菌株。经过筛选得到阳性P. Pastoris 重组
子。重组菌株经甲醇诱导培养,表达产物的Western 印迹结果表明,HBcAg 蛋白能在甲醇型酵母
( Pichia Pastoris) 中诱导表达,产物为一2115kDa 的蛋白。经蔗糖密度梯度超离心和CsCl 密度梯
度超离心纯化后,ELISA 和密度测定结果表明重组HBcAg 蛋白主要分布在密度为112576gPml 和
113013gPml 的2 个峰值处。电镜观察表明,该重组HBcAg 蛋白能自主装配成大小不同的2 种颗
粒(即核心颗粒) ,大颗粒直径约34nm 左右,小颗粒直径约30nm 左右。同时,我们还观察到,该核
心蛋白颗粒在体外可发生集聚现象。
关键词　HBcAg 　Pichia Pastoris 表达　纯化　核心颗粒　抗原

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酿酒酵母表达的rHBcAg 颗粒的纯化和鉴定及其透射电镜观察
陈 恒1, 2, 3，梁婉琪3，张大兵3**
(1. 上海交通大学生命科学技术学院，上海 200030; 2. 上海大学生命科学学院，上海 200436;
3. 上海市农业科学研究院生物技术中心，上海 201106)
Purification and Observation of the Recombinant Hepatitis B Virus Core
Antigen (rHBcAg) Particles Produced in the Yeast
CHEN-Heng1, 2, 3, LIANG Wan-qi3, ZHANG Da-Bing3**
(1.School of Life Science and Biotechnology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030,China; 2. School of Life
Science, Shanghai University, Shanghai 200436,China; 3. Biological Technology Center of Shanghai Agriculture Science
Institute, Shanghai 201106,China)
Abstract: Hepatitis B virus core antigen protein gene (C gene) was expressed in Saccharomyces
cerevisiae and the products (rHBcAg particles) were purified from crude lysate of the yeast by three
steps: Sephrose CL-4B chromatography, sucrose step-gradient ultracentrifugation, and CsCl-isopycnic
ultracentrifugation. rHBcAg was synthesized in yeast cells as a particle consisting of polypeptides
which have a molecular weight of 21.5 kDa (p21.5). ELISA and CsCl- isopycnic ultracentrifugation
purification products (rHBcAg particles) in each fraction indicated that the particle densities of the
fraction with higher rHBcAg antigenicity mainly distributed at the densities of 1.27g·mL-1 and 1.40
g·mL-1, respectively. Observation of the purified products (rHBcAg particles) by TEM indicated that
rHBcAg peptides could self-assemble into two kinds of different sizes of rHBcAg particles (core
particles); the large particle was about 30.1±2.4 nm in diameter and the small particle about 21.5±3.3
nm. This indicated that the rHBcAg particles displayed dimorphism, but the biological significance of
this dimorphism is not clear and needs to be studied further.
Key words: rHBcAg; Saccharomyces cerevisiae; rHBcAg particles; Ultracentrifugation; Transmission
electron microscopy
摘要：乙肝核心抗原（HBcAg）蛋白基因(C 基因)在酿酒酵母中表达，表达产物经过分离和Sepharose CL-4B 柱子
的初步纯化。产物经SDS-PAGE 和Western blotting 鉴定为一分子量约21.5kDa 的多肽。再经蔗糖密度梯度超离心
和CsCl 等密度梯度超离心等过程而被纯化。分管收集的超离心纯化产物经ELISA 抗原活性检测和密度分析，可
知ELISA 反应强度较高的收集管中的颗粒密度主要分布在1.27g/mL 和1.40 g/mL 两个峰值处。将rHBcAg 抗原活
性最高的收集管合并，再经TEM 观察，发现酵母表达的rHBcAg 蛋白（核心蛋白）能自主装配成大小不同的两
种核心颗粒，大颗粒直径约为30.1±2.4 nm，小颗粒直径约为21.5±3.3 nm。这表明，酿酒酵母表达的rHBcAg
颗粒具有大小不同的二态性，其生物学意义还未明了，需进一步研究和探讨。
关键词：重组乙肝核心抗原蛋白(rHBcAg protein); 酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）;核心抗原颗粒(rHBcAg
particles); 超离心; 透射电子显微镜
中图分类号：Q5 文献标识码：A 文章编号：1003-5152(2004)02-0101-04

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DNA疫苗研究进展

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H_E染色和AKPase活性对组织细胞的组化测定方法

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nuclear medicine

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不同因素对酶联免疫法测定破伤风免疫球蛋白活性的影响
侯燕婷1 , 2 , 汪群慧1 , 孔英俊2 , 罗　坚2 , 苏志国2
(1. 北京科技大学土木与环境工程学院, 北京100083 ;
2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室, 北京100080)
　　摘　要:目的考察不同因素对酶联免疫法( ELISA) 测定破伤风免疫球蛋白生物活性的影响。方法将破伤风
免疫球蛋白加入不同pH的缓冲液、不同浓度的氯化钠、硫酸铵以及聚乙二醇(PEG,相对分子质量为1 000 ,6 000 和
10 000) 溶液,采用ELISA 法测定其活性。结果pH 5～9 的缓冲溶液对活性测定的影响不大,而pH ≤4 和≥10 的缓
冲溶液都会使测定值显著降低,当pH < 2 或pH > 12 时,活性下降到正常值的10 %以下。随氯化钠浓度的增加测定
值先下降到正常值的37. 3 % ,后回升到41. 2 % ,再下降;随硫酸铵浓度的增加测定值先下降到正常值的67 % ,后回
升到99. 4 % ,再下降。PEG对活性测定有较大影响,随PEG浓度的增加活性测定值降低。结论缓冲液pH、盐以及
PEG对破伤风免疫球蛋白活性测定有影响。
　　关键词: 破伤风免疫球蛋白; 酶联免疫分析; 活性
　　中图分类号:R392. 33 　　文献标识码:A 　　文章编号:100521678 (2007) 0520301203

a324120005

谢谢楼主啊 找到一个自己喜欢的

zhanghj04

谢谢分享  非常有用

zhanghj04

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dongqiang

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