Fromont-Racine等人［13,14］以10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”, 从含有约5×106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行第一轮筛选(这些基因组DNA与AD的基因融合构成“猎物”表达载体)。 经过对阳性克隆“猎物”DNA的序列分析, 他们把这些DNA分成两大类共5项(图1)： 编码蛋白质的DNA和非编码蛋白质的DNA, 前一类分为四项： A1是在序列上彼此有部分重叠的克隆群。 这一项也是首先分析考虑的对象； A2和A3分别是靠近ORF起始密码子的编码蛋白质N-末端的片段和ORF内部的大编码片段, A4是其他的编码序列。 这四项优先考虑的顺序是： A1>A2>A3>A4。 根据分析把从中得到的4种靶蛋白做成新的“诱饵”进行第二轮筛选。 再把从中得到的一种“猎物”做成“诱饵”进行第三轮筛选。 如此经过三轮共十五次筛选, 他们从中共得到约700个阳性克隆并且对大多数作了部分测序。 这些筛选到的靶蛋白中, 有9种是已知的mRNA前体剪接因子, 5种是新发现的剪接因子, 8种是与RNA其他加工过程有关的因子, 还有45种与其他的功能有关。 另外有9种是转录激活因子, 这主要来自假阳性克隆。 他们不仅发现了已知剪接因子与其他因子的相互作用, 鉴定了一些新的因子, 而且建立了这个剪接途径与其他代谢途径的联系。
与此类似, Hudson等人也正在进行酿酒酵母的蛋白质组的研究分析工作［14］。 他们把酵母所有的即约6 000多种蛋白质开放读码框(ORF)，分别构建成与DB和AD基因融合的表达载体。 两类载体分别转化不同接合型酵母菌株。 6 000株分别表达不同的AD-ORF即“猎物”的细胞在16张384孔微滴定板上培养, 再取少许菌液点在只表达一种BD融合蛋白的细胞形成的菌苔上使两种细胞接合形成二倍体, 然后按照常规的双杂交技术鉴定“诱饵”和AD融合蛋白是否发生相互作用(图2)。 整个过程主要是在384孔微滴定板上完成的。 和Fromont-Racine等人的方法相比, 这个方法的优点是操作过程可最大程度地自动化, 微滴定板的使用也大大提高了处理量。 这项工作虽已由Frederickson作了介绍, 但目前为止尚未见到它正式发表。 根据Frederi-ckson的评论, 这个方法如果成功的话, 那末它很有可能在人类蛋白质组研究中得到应用。 4 结束语
酵母双杂交技术问世不到十年, 但已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等诸方面发挥重要作用。 双杂交技术固然有其内在的不足之处, 如通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生, 也即所谓的假阳性； 假阴性现象也是双杂交分析过程中经常碰到的问题； 一些对细胞致命的蛋白质也不适宜通过双杂交系统来分析。 双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性, 这种可能还必须经过其他实验验证, 尤其要与生理功能研究相结合, 否则可能会误入歧途。 虽然如此, 该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必要手段。 技术的发展与创新、研究成果的迅速共享为建立有机体的全部蛋白质(蛋白质组组分)的相互作用及其功能关系图谱提供了基础和条件。 我们不奢望通过双杂交系统能发现所有真实的蛋白质相互作用, 但在没有更好的方法问世之前, 双杂交技术仍是开展这类研究的有力工具。
