2、效应阶段
Elbashir等在果蝇体外系统中加入合成21～23nt 的siRNA， 使之能有效降解同源mRNA， 而当siRNA 浓度增加到一定阈值时，mRNA 降解程度不再继续增加，提示在果蝇裂解液中含有一定数量RNAi 所需蛋白因子。进一步研究得知RNAi 所需蛋白因子是一种复合物，被称为RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC) 。RISC 是一种核糖核蛋白，包含有RNA 和蛋白成分。其中的RNA 就是siRNA，其蛋白成分包括AGO22、VIG 和dFXR 以及Dmp68 等，实验证实这些成分是RISC 的一部分且为RNAi 所必需。在剪切过程中siRNA 的结构起了重要作用，具有典型结构的siRNA 较平末端siRNA 更能有效引起RNAi 作用，尤其是3′端外悬的第2 个核苷酸影响siRNA 对靶mRNA 的剪切作用。另外，siRNA 对靶mRNA 剪切具有精确的序列特异性。
3、倍增阶段
以往实验发现仅需少量siRNA 即可引起强烈同源基因表达抑制，因此众多学者推测在RNAi 过程中存在倍增放大机制。有人认为在前述的mRNA剪切过程中产生的21～23nt 片段可能会作为新的siRNA 而继续参与RNAi 过程， 从而使干扰作用放大。这种扩增机制只是一种推测，是否存在尚需进一步的实验研究确定。RNAi 的系统性作用也是其引起人们关注的重要原因，但机制不明。Spankuch Schmitt 等在乳腺癌细胞系、子宫颈癌细胞系、结肠癌细胞系等细胞中成功进行了RNAi 实验，并观察到癌细胞增殖明显减少、凋亡显著增加。Krichevsky 等用合成的siRNA 导入有丝分裂后期的原代神经元中，有效抑制了其内源性基因表达，使应用RNAi 技术研究神经发育及功能调控成为可能;不久前Song 等在小鼠体内进行RNAi 实验，有效抑制了Fas21 基因表达，从而延长了患自身免疫性肝炎小鼠的生命，为进行RNAi 的动物实验奠定了实验基础。随着RNAi 作用机制的进一步明确、应用技术的完善成熟，RNAi 技术必将为人类研究基因功能，以及对癌症等疾病进行基因治疗提供强大武器。
RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，但这并不是说反义链上所有的碱基都对发挥这种特异性起到了相同的作用。因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应，相对而言，3´末端的核苷酸序列并不要求与靶mRNA完全匹配。
miRNA的生成及作用机制
与小分子siRNAs相比，尽管两者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的差异。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生，而成熟miRNAs的产生要复杂一些，首先pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004)；这些pre-miRNAs在Exportin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。两者的作用机制上也存在差别，成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。而在siRNA通路中，单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA，而siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译。
