四．siRNA表达载体
上面3种方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这种方法有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA的数量不受控制。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链序列克隆入载体内，位于RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。
该方法的优点是使siRNA直接在体内得到表达，是用于RNAi长期研究的唯一方法。在载体上的抗性标记能帮助快速筛选出阳性克隆，目前包括Ambion在内的一些公司已开发出病毒类的载体（如腺病毒载体），这样就可使siRNA进入更多种类的细胞内进行研究。由于此方法涉及构建克隆，所以需要进行大量的实验，如构建克隆、序列测定等。现在Ambion公司能够提供10种质粒载体，其中带有不同的启动子与抗性标记，如小鼠的U6启动子、人的U6启动子、人的H1启动子，抗性标记有嘌呤霉素、新霉素、潮霉素。
五．siRNA表达框
siRNA表达框的本质是一段含有能表达siRNA分子的PCR产物，无需克隆入载体即可导入细胞抑制特定基因的表达。在表达框的上游含有RNA聚合酶III的启动子，在下游含有RNA聚合酶III的终止序列。siRNA表达框介导的siRNA表达也属于体内表达的方法，与siRNA表达载体相比其优点是无需克隆可直接导入细胞，但在表达框的两端加上酶切接头后也可克隆入载体，方便客户使用。Ambion公司的SilencerTM siRNA Expression Cassette Kit就是采用该方法的试剂盒。
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比较项目 |
化学合成 |
体外转录 |
RNase III降解dsRNA |
质粒载体 |
腺病毒载体 |
逆转录病毒 |
PCR |
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材料需求 |
21-mer RNA |
29-mer DNA oligos(一对) |
转录模版 |
55-60-mer DNA oligos |
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~50-mer DNA oligos(一对) |
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全部制备/ |
4天—2周 |
24 小时 + DNA oligo合成时间 |
1 天 + 转录模版制备时间 |
5天以上 + DNA oligo合成时间 |
~ 6 小时+ DNA oligo合成时间 |
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个人所需 |
几乎不需要 |
中等 |
中等 |
多 |
多 |
多 |
中等 |
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是否需要验证和寻找最有效siRNA |
需要 |
需要 |
不需要 |
需要 |
需要 |
需要 |
需要 |
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能否标记siRNA |
能 |
能 |
能 |
不能 |
不能 |
不能 |
不能 |
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转染的相对 |
好 |
好 |
好 |
中等 |
好 |
很好 |
很差 |
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可筛选性 |
不可以 |
不可以 |
不可以 |
可以 |
可以 |
可以 |
不可以 |
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能否适用于长效抑制 |
不适用 |
不适用 |
不适用 |
不适用 |
不适用 |
适用 |
不适用 |
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能否大规模制备 |
可以 |
有限 |
有限 |
可以 |
可以 |
可以 |
有限 |
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检测总体转染效率 |
不可以 |
不可以 |
不可以 |
可以 |
可以 |
可以 |
不可以 |
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每个基因的相对费用（不包含人力） |
很高 |
中等 |
低 |
低 |
高 |
中等 |
中等 |
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优点 |
方便，几乎无需研究人员工作。 |
得到siRNAs的时间短。 |
无需检测和筛选有效siRNA序列，较省钱。 |
可以简单地大量制备 |
导入效率高，可感染静止期的细胞 |
RNAi效果可永久持续 |
得到siRNAs的时间非常短。 |
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缺点 |
费用高，定制周期长。 |
实验规模受到限制。 |
可能易引发非特异性沉默。 |
RNAi效果持续时间短，导入效率低 |
RNAi效果持续时间短，制备病毒较费时间 |
不能感染静止期的细胞。 |
很难转染。 |
